用多个基因组构建泛基因组图

节点、边和路径分别表示什么#

一个变异区域可能在相同的入口和出口之间出现多条路径。沿不同路径读出碱基，可以得到不同等位序列。图中的复杂分支也可能来自重复或比对不确定性，不能只数分支就得到可靠的变异数量。vg 图模型

泛基因组描述当前纳入基因组的序列集合。核心序列与存在／缺失差异取决于比较范围和判断标准，不能由“参考基因组”和“其他基因组”的名字直接划分。图也不会自动包含尚未测序或没有成功组装的序列。

选择建图输入与参考#

Minigraph-Cactus 先建立结构差异的图，再将输入组装比对回去，用 Cactus 处理碱基层面的对应关系。结构变异通常包括较大片段的插入与缺失，也包括倒位或重排；碱基级比对还能表示更小的替换和插缺。Minigraph-Cactus 流程说明

这条流程主要面向同一物种或序列比较接近的组装。默认按参考染色体拆分计算，参考组装需要有可靠的染色体尺度结构。差异很大的跨物种比较应另外评估比对方案。

输入中每份 FASTA 应有清楚的个体与单倍型来源，同一文件内的序列名称不能重复。不要把主组装和同一次运行的全部替代片段当成独立个体重复加入。参考选择同时决定默认的染色体划分与变异坐标，应记录参考版本。输入命名与参考要求

写好基因组清单#

data/assemblies.txt 是两列文本，第一列是组装名称，第二列是 FASTA 路径，中间用空白分隔。下面只展示命名与列格式，行数按实际输入增减。

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reference /absolute/path/reference.fa
2
assembly.1 /absolute/path/hap1.fa
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assembly.2 /absolute/path/hap2.fa

assembly.1 和 assembly.2 展示同一个体两套单倍型的命名。点号在 Cactus 中有特殊含义，表示单倍型编号；不要在普通样本名称中随意加入点号。reference 是显式选定的参考组装名称，必须与命令中的 --reference 一致。

清单使用绝对路径可以减少工作目录切换带来的问题。文件在容器中也必须可见；若输入在其他磁盘，后面的容器命令需要同时绑定那些目录。

固定容器版本并运行建图#

本篇使用 Cactus v3.2.1 的接口。容器封装了依赖，镜像名中保留版本便于复现；不要把镜像文件的名称当成版本证据，仍需保存下载来源和运行日志。Cactus 安装说明

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mkdir -p images work results/graph logs
2
singularity pull images/cactus-v3.2.1.sif \
3
  docker://quay.io/comparative-genomics-toolkit/cactus:v3.2.1
4

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singularity exec --bind "$PWD:$PWD" --pwd "$PWD" \
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  images/cactus-v3.2.1.sif \
7
  cactus-pangenome work/cactus-jobstore data/assemblies.txt \
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  --reference reference \
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  --outDir results/graph --outName pangenome \
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  --maxCores 8 --binariesMode local \
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  --gfa full clip --gbz full clip --vcf \
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  > logs/cactus-pangenome.log 2>&1

--binariesMode local 表示使用容器内的程序，避免在容器内再启动另一层容器。work/cactus-jobstore 保存任务状态和中间数据，第一次运行时不要预先建立这个目录；--outDir 才是结果目录。任务中断后，应按原版本的重启规则恢复，不要把半成品目录当作一次新的完整运行。

--maxCores 8 将本次单机执行的 CPU 核数上限设为 8，内存另行配置。大图仍可能因内存或临时磁盘不足而失败，需根据任务日志和计算节点配额调整资源。Cactus 命令入口

分开保留完整图与裁剪图#

上述命令请求两种图及相应 GBZ，同时输出默认参考上的 VCF。

full 表示未做这一阶段的裁剪，不保证所有原始输入碱基都成功进入图。前面的序列分配或比对过程仍可能排除部分输入。输出 VCF 描述建图组装之间的差异，尚未利用新的重测序样本推断基因型。

--clip 控制未对齐区域的裁剪，不能解释成“删除比阈值短的所有末端序列”。--filter 控制低单倍型支持节点的过滤，可能丢掉稀有差异；需要研究存在／缺失变异时，要保留能回查的完整图。不同版本的默认行为会变化，参数应与固定版本的图后处理文档对应。

不要用一个长度阈值解释所有结构变异

旧笔记中的 --minLen 不能作为这套接口通用的“最小结构变异长度”开关。输入片段过滤、比对过滤与图裁剪发生在不同步骤。调整前应确认该参数属于哪个子命令，以及它改变的是输入片段、比对关系还是最终节点。

检查图是否包含预期路径#

GFA 的 S 行记录序列片段，L 行记录连接；这里的 W 行记录带样本与单倍型信息的行走路径。vg 可以汇总图规模并列出路径。

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vg stats -N -E -L results/graph/pangenome.full.gbz \
2
  > results/graph/graph-stats.txt
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vg paths -L -x results/graph/pangenome.full.gbz \
4
  > results/graph/graph-paths.txt

检查每个输入是否有对应路径，参考染色体名称是否符合预期，再查看缺失片段相关日志。路径存在只能证明某些序列进入了图，不能单独证明整条染色体完整。vg 路径与统计工具

下一篇使用 clip 图演示普通短读段比对。全图用于注释或序列保留检查时，另存一套明确命名的文件，不要与用于比对的图和索引混用。