scRNA-seq 测量的是什么

名字里的几个部分#

scRNA-seq 是 single-cell RNA sequencing 的缩写，中文是单细胞 RNA 测序。传统的混合样本 RNA 测序常被叫作 bulk RNA-seq；这里的 bulk 表示把许多细胞放在一起测量。

两者回答的问题不完全相同。混合样本中一个基因的信号升高，可能是某类细胞更多了，也可能是同类细胞内部的表达变高。单细胞数据有机会把这两种变化分开，但前提是采样、注释和统计设计支持这种比较。

一条读段怎样找到对应的细胞#

以本专栏采用的液滴式 3′ 端基因表达建库为例，实验把细胞与带有标签的试剂分配到反应单元中，将部分 RNA 逆转录成 DNA，再扩增和测序。3′ 端读作“三撇端”，这里表示主要从转录本的一端获取用于计数的序列，而不是覆盖每条 RNA 的全长。

软件至少要辨认三类信息：

UMI 是 unique molecular identifier 的缩写，可以理解为给分子附加的一段短标签。Cell Ranger 会结合条形码、基因归属和 UMI 进行纠错与计数，具体规则见官方基因表达算法说明。

测到十条相同来源的读段，不一定意味着捕获了十个不同 RNA 分子。标签碰撞与测序错误会影响 UMI 计数，捕获效率也会影响结果。

表达矩阵中的一个格子#

下游分析通常把数据排成“细胞 × 基因”的矩阵。第 c 行、第 g 列记录这个细胞在这个基因上被计数的分子数：

这些计数记录了实验实际观测到的部分 RNA。实验只捕获其中一部分，分子还要经过逆转录和扩增，再经过测序和软件筛选。因此，某个格子为 0，既可能是该细胞当时没有表达，也可能只是没有捕获到足够信息。

零值不是必须填补的缺口

低表达、有限测序深度和技术采样都可能产生零值。基础流程不会把每个零都补成正数。平滑或填补会改变表达分布，不能将处理后的数值再当作真实分子计数。

图 1 · 细胞中的基因表达计数

从 Kang 2018 的对照细胞中，按来源文件的四类细胞注释各取三个细胞，展示八个基因的计数。每一行对应一个细胞，每一列对应一个基因；颜色表示 ln(1 + UMI)。

来源：Kang 2018 / Pertpy 数据入口。

单细胞、单核与全长测序不能混为一谈#

单核 RNA 测序（snRNA-seq）从细胞核获得 RNA。它适合某些难以获得完整活细胞的材料，但核内 RNA 组成与整细胞不同，未剪接转录本的比例也可能不同。剪接指转录本去除内含子、连接外显子的过程；外显子和内含子是基因结构中的不同组成部分。

是否把比对到内含子的读段计入表达，必须和软件版本、参考注释及分析对象一起记录。Cell Ranger 从 7.0 起默认纳入内含子相关计数，见版本对应的说明。默认行为不应被误写成“只有单核数据才这样处理”。

全长测序尝试覆盖转录本更广的区域，适合回答一些转录本结构问题。不同全长方案对 UMI 的使用也不同。这里的 UMI 计数流程不能直接套到所有全长数据上，更不能把基因计数、读段计数和转录本丰度混在同一个统计模型中。

生物样本、建库单元和细胞#

分析前至少要区分这三个层级。

• 供体或实验个体：来源不同的人、动物或其他实验单位。
• 生物样本：某个实验个体在一个条件、时间点或取材位置获得的材料。
• 建库单元：一次独立捕获、建库所产生的文件和条形码集合；同一生物样本可能拆成多个技术重复。

细胞是这些样本中的观测单位。比较两种条件时，若每种条件只来自一个供体，即使总共有一万个细胞，也不能据此估计多个供体之间的自然差异。反过来，同一个供体在处理前后都采样，也不能当作两个毫无关系的人。

这一点会影响第七篇的差异表达。已有系统评估显示，忽略细胞共享同一生物来源，会产生大量错误发现；见 Squair 等人的比较研究。

第一张二维图之前，还要做什么#

测序读段先经过比对和计数，生成矩阵；然后检查条形码是否像真实细胞，处理低质量细胞、双细胞和背景 RNA，再进行归一化、降维与聚类。

双细胞指同一反应单元中进入了两个或更多细胞，观测表达可能是它们的混合。背景 RNA指破损或游离细胞释放的 RNA。它可能进入其他反应单元。两者都是技术解释的一部分，不能一看到混合标记就宣布发现新的细胞类型。

最后还要根据多个标记基因和组织背景给细胞群命名。二维图是这些计算的可视化，不是组织的真实空间位置，也不能只凭两个点群相距较远，就断定它们有更远的发育关系。

下一篇从测序文件开始，说明比对、分子计数和表达矩阵之间的对应关系。