零基础起步 · scRNA-seq 与 Scanpy · 7 篇
单细胞组学入门
先从 scRNA-seq 开始，介绍测序原理、表达矩阵、质量控制、聚类注释、多样本整合和按生物学重复进行差异表达分析的流程。
从这里开始
- 01 scRNA-seq 测量的是什么 从 RNA、细胞条形码与 UMI 开始，理解单细胞表达计数、单核与全长测序的区别，以及细胞数量和生物学重复的关系。
- 02 从 scRNA-seq 读段到表达矩阵 说明 Cell Ranger 的输入、计数过程和输出，区分原始矩阵与细胞筛选后的矩阵，检查参考版本、条形码和基因标识。
- 03 导入 scRNA-seq 矩阵，检查细胞质量 用 Scanpy 读入表达计数，保留稳定基因标识和实验元数据，检查线粒体比例、低质量细胞、双细胞与背景 RNA。
- 04 从表达计数到归一化、降维和聚类 用 Scanpy 解释总量归一化、对数变换、高变基因、主成分、近邻图、Leiden 聚类与 UMAP，并保留未改变的计数。
- 05 给细胞群命名：标记基因与注释证据 从聚类编号出发，结合探索性标记排序、多个基因的表达模式和参考注释给细胞群命名，区分标记发现与条件间差异表达。
- 06 合并多个单细胞样本，再判断是否需要整合 保留供体和建库身份合并多个计数对象，对照整合前后的细胞结构，解释 Harmony 的使用范围以及不能消除的实验混杂。
- 07 按生物学重复比较单细胞表达差异 区分细胞群标记与条件差异，按生物样本汇总同一细胞类型的原始计数，再用负二项模型比较表达并解释效应和多重检验。
先看清一个细胞里测到了什么
单细胞分析常见的第一张图，是一团颜色不同的点。要知道这些点代表什么，需要先弄清楚：测序记录了什么，软件怎样把读段变成计数，哪些细胞被保留下来，以及颜色和分组是谁定义的。
第一阶段以单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）为主线，先讲常见的液滴式 3′ 端、带分子标签的基因表达数据。流程分为生成表达矩阵和分析表达矩阵两部分；已经拿到矩阵时，可以从第三篇开始。
第一阶段的七篇文章
| 篇章 | 主要问题 | 这一篇留下什么 |
|---|---|---|
| scRNA-seq 测量的是什么 | 读段、分子、细胞和生物学重复是什么关系 | 对数据和实验设计的基本判断 |
| 从测序读段到表达矩阵 | Cell Ranger 做了哪些计算，怎样读输出 | 表达矩阵、比对与质控报告 |
| 导入矩阵并检查细胞质量 | 怎样保存计数、连接样本信息和处理双细胞 | 经过检查的计数对象 |
| 归一化、降维和聚类 | 一张计数表怎样变成分组和二维图 | 聚类对象与诊断图 |
| 给细胞群命名 | 怎样结合多个标记与参考证据作注释 | 细胞标签与注释依据 |
| 合并多个样本，再判断是否整合 | 批次差异与生物差异怎样区分 | 整合前后的对照结果 |
| 按生物学重复比较表达差异 | 为什么一万个细胞不能替代多个供体 | 样本级计数、效应和统计检验 |
第三至五篇先处理一个建库单元。多个样本分别完成质控后，在第六篇合并，并重新聚类、检查注释。第七篇比较同一细胞类型在不同实验条件下的表达。
关于配图配图使用 Kang 2018 的公开计数重新分析。数据包含八名供体的对照与刺激条件，差异表达采用“供体 + 条件”的配对模型。数据入口